Известный немецкий генетик Рихард Гольдшмидт - автор классических исследований по физиологической генетике и генетике пола, прошел парадоксальный путь в развитии своих эволюционных взглядов. В течение 20 лет он изучал микроэволюционные процессы в популяциях непарного шелкопряда. Сперва убежденный дарвинист, он пришел к заключению, противоречащему теории Дарвина: формирование географических рас не ведет к видообразованию, естественный отбор не имеет конструктивного начала, а лишь устраняет неудачных мутантов. В начале 30-х гг. он радикально преобразовался в макромутациониста де-фризовского толка и в книге "Материальные основы эволюции" [Goldschmidt, 1940] аргументированно изложил свои взгляды на эволюцию. Мы еще будем касаться его эволюционных воззрений, здесь же заострим внимание на трактовке системных мутаций, которым он отводил ведущую роль в видообразовании. Гольдшмидт рассматривает вид как генетически закрытую систему, или, как он выражался, независимую реакционную систему (a single reaction system). Межвидовые изменения не могут быть вызваны изменением степени сложности или аддитивностью мелких мутаций - это полное преобразование исходного паттерна или реакционной системы в новую, которая затем может снова продуцировать внутривидовые вариации посредством микромутаций. Гольдшмидт называет этот тип генетических изменений системной мутацией и полагает, что в ее основе лежит преобразование хромосомного паттерна. Возникает новая, пространственно отличная упорядоченность хромосомного аппарата. Этот новый паттерн, видимо, формируется постепенно в серии последовательных этапов, которые могут проходить без видимого эффекта до тех пор, пока реорганизация хромосом не приведет к появлению новой стабильной системы.

Таким образом, Гольдшмидт полагал, что помимо известных микро- (генных) и макро- (хромосомных) мутаций должен существовать еще один тип - системные мутации, которые связаны с перетасовкой (scrambling) интимной хромосомной архитектуры, происходящей в редких случаях и предопределяющей удачное (или неудачное) событие, связанное с видообразованием [Goldschmidt, 1952].

Идея Гольдшмидта подверглась ожесточенной критике большинства эволюционистов 40-х - 60-х гг. (Э. Майр, Ф. Добржанский, Дж. Симпсон). В то же время ряд крупных биологов (А. Дальк, О. Шиндевольф, К. Уоддингтон) отнеслись к "системной мутации" с сочувствием, находя новые факты и теоретические подходы в се защиту.

Пожалуй, наиболее близок к нашему пониманию принципов системной реорганизации архитектоники генома генеративной сферы был бельгийский зоолог Альберт Дальк [Dalcq, 1949]. Его термин "онтомутация" был предложен для обозначения глубоких, резких, радикальных и вместе с тем жизнеспособных трансформаций, возникающих в цитоплазме яйцеклетки как морфогенетической системы. Дальк считал, что ранние стадии эмбриогенеза, а также главные морфологические параметры развивающегося организма детерминируются еще до оплодотворения - в ходе оогенеза. Как и Гольдшмидт, Дальк полагал, что, помимо реорганизации цитоплазмы, онтомутация связана с общим изменением всей ядерной системы. Однако, если системные мутации по Гольдшмидту - это единичные события и главной трудностью у "многообещающего урода" при этом является отсутствие партнера для спаривания, то для онтомутации Далька это затруднение снимается. Онтомутации вызываются резкими изменениями внешних факторов среды, которые одновременно влияют на всех самок в популяции в период созревания яйцеклеток. Воздействие среды на ооциты осуществляется в период их развития как непосредственно, так и за счет окружающих их питающих и фолликулярных клеток. Такие воздействия среды могут быть однонаправленными и многократными, вызывая накопление идентичных онтомутации в популяции [Dalcq, 1955, 1957 ].

Одновременно с Дальком сходную концепцию развивал французский биолог Альбер Вандель, считавший, что именно эмбриология, а не генетика стимулирует прогресс эволюционной теории: зародышевые изменения, происходящие в яйце, а не генные мутации - суть эволюционных реорганизаций. Организация яйца (его общая архитектура) является основой для сопоставления видов и филогенетических групп [Vandel, 1948].

Большинство хромосомных мутаций связано с изменением линейного расположения хромосомных блоков внутрихромосомного (инверсии) или межхромосомного (транслокации, центрические слияния) характера. Эти типы перестроек связаны не с количественными изменениями хромосомного материала, а лишь с его перераспределением в пределах одной хромосомы или всего набора. Другие хромосомные перестройки - типа дупликаций или делеций изменяют количество хромосомного материала. Есть основания считать, что все типы хромосомных мутаций, за исключением центических слияний, относятся к разряду необратимых событий, уникальных в смысле локализации хромосомных разрывов, возникающих при образовании этих перестроек. Уникальность хромосомных перестроек подчеркивает их принципиальное отличие от генных (аллельных) мутаций и особое значение в эволюционных событиях. Хромосомные перестройки относятся (по Гольдшмидту) к макро-мутациям, имеющим как внутривидовое значение (например инверсионный полиморфизм), так и видообразовательный смысл (фиксированные инверсии, транслокации, центрические слияния). Эволюционное значение хромосомных перестроек на примере инверсий мы рассмотрим в следующей главе.

Геномные мутации связаны с изменением количества хромосом, возникают в силу нарушений в аппарате веретена и бывают кратными (например полиплоидия) и не кратными (анеуплоидия). С этим типом мутаций в основном связывают видообразование (полиплодия), иногда внутривидовой полиморфизм (чаще анеуплоидия). По мнению В. Гранта [1991], подавляющее большинство папоротникообразных и покрытосеменных растений произошло за счет полиплоидии.

В чем же заключаются отличия принципиально новой хромосомной реорганизации, впервые обнаруженной нами у малярийных комаров [Стегний, 1979а] и названной системной мутацией [Стегний, 19876 ], от вышеприведенных общеизвестных типов мутаций? При системных мутациях не изменяется ни генный состав, ни линейная хромосомная структура, ни количество хромосом (или хромосомных участков). Таким образом, их нельзя отнести ни к одному из известных типов мутаций.

Системные мутации возникают в результате пространственной реорганизации интерфазных хромосом в ядре за счет изменения хромосомно-мембранных взаимоотношений. Другие особенности системных мутаций связаны с тем, что они являются видоспецифичными и не обнаруживают внутривидового или популяционного полиморфизма (при анализе большого числа особей у разных видов); четко выявляются только в геномах генеративной ткани (в частности в трофоцитах), тогда как в изученных соматических тканях их визуализацию провести не удалось.

Видоспецифичность организации хромосомного аппарата трофоцитов яичников ставит немаловажный вопрос: имеет ли эта структурная организованность отношение к функции питающих клеток - обеспечение накопления упорядоченной морфогенетической информации и запасных питательных веществ в цитоплазме яйцеклетки? Можно предположить, что имеет, причем элементы упорядоченности ооплазмы могут формироваться на основе топологической информации, которая свойственна геному каждой из питающих клеток в отдельности, и в то же время - на основе целостной системной информации, определяющейся взаиморасположением геномов всей группы трофоцитов по отношению друг к другу и к ооциту.

Изученный в плане групповой архитектоники геномов трофоцитов малярийный комар Anopheles messeae, как и другие виды, имеет 7 трофоцитов, расположенных на полюсе фолликула, противоположном локализации ооцита (рис. 3.1,6). При этом трофоциты формируют сферообразную систему, выпуклую по отношению к ооплазме. Три трофоцита, непосредственно прилегающих к ооплазме, отличаются более крупными размерами (и более крупными хромосомами). Четыре трофоцита, имеющих периферическое расположение, уступают размерами, при этом отношение диаметров самого мелкого ядра второй группы и самого большого ядра первой группы составляет около 1:2. Очевидно, что и степень политенизации хромосом трофоцитов также различна в данных группах клеток. В связи с этим можно с определенностью сказать о зна-чительно более высокой активности синтеза РНК в трофоцитах, прилегающих к ооплазме.

Учитывая, что топология хромосом всех трофоцитов вида идентична, что было доказательно представлено в главе 2, мы попытались ответить на вопрос: существует ли групповая упорядоченность хромосом всех семи трофоцитов по отношению друг к другу и к ооплазме? Методически это оказалось довольно трудно, так как необходимо было оценивать нераздавленный фолликул, в котором не нарушена организация трофоцитов. С другой стороны, наличие жестких хромосомно-мембранных связей хромосомы 3 и Х-хромосомы облегчало решение задачи, так как участки прикрепления хромосом к мембране являются хорошими маркерами суперпозиции отдельных трофоцитов по отношению друг к другу и к ооплазме. После удаления оболочки фолликула, состоящей из мелких клеток эпителия, с помощью стереомикроскопа можно было визуально оценивать взаиморасположение ядер трофоцитов по "торчащим" центромерным участкам хромосомы 3 (см. рис. 3.1,а), связанным с оболочкой ядер.

Рис. 3.1. Взаиморасположение ооцита, ооплазмы и хромосомно-мембранных контактов группы трофоцитов у малярийного комара Anoplieles niesseae. а - ядро трофоцита, СЗR, C3L - центромерные участки хромосомы 3; б - общий вид фолликула; в - увеличенный снимок группы трофоцитов. Стрелками показаны зоны прикрепления хромосомы 3 к ядерной оболочке.

Рис. 3.2. Схема взаиморасположения ооцита (00), ооплазмы и трофоцитов (Тф) малярийного комара Anopheles messeae. На трофоцитах показаны места прикрепления хромосомы 3. Угол разброса точек прикрепления по отношению к ооциту и ооплазме составляет около 100°

Анализ большого числа фолликулов, удачно ориентированных боковой областью перпендикулярно оси объектива, показал, что центромерные участки хромосомы 3, связанные с ядерной мембраной, направлены в сторону ооплазмы у всех 7 трофоцитов фолликула (б, б). При этом, если мысленно провести осевую линию вдоль фолликула, то направленность прикрепленных участков хромосомы 3 может колебаться в пределах 100° к плоскости ооплазмы (рис. 3.2). Учитывая сферичность организа-ции группы семи трофоцитов. можно предположить, что эти отклонения связаны с ошибкой визуального наблюдения. XL-плечо Х-хромосомы у A. messeae прикреплено к ядерной оболочке боковой областью (см. рис. 2.4,а). Об ориентации XL-плеча в ядрах 7 трофоцитов можно было судить по редким удачно расположенным группам трофоцитов.

Дело в том, что при просмотре ядер в дорзовентральной (боковой) плоскости, когда возможна четкая идентификация прикрепленных к оболочке плеч 3R и 3L, хромосому XL обнаружить не удавалось. Если же (в редких случаях) наблюдение велось с "полюса" (торцевой части фолликула), то XL-плечо оказывалось видимым, тогда как хромосома 3 исчезала из поля зрения. Поэтому мы предположили, что плоскость расположения XL-плеча перпендикулярна плоскости центромерной области хромосомы 3, связанной с оболочкой ядра.

Таким образом, можно сделать вывод о коориентации хромосомных структур группы трофоцитов по отношению к ооплазме и собственно ооциту. Открытие этого явления позволяет гипотетически оценить его роль в формировании оогенетической сегрегации.

Еще недавно доминировало мнение, что морфогенез - формирование зародыша из оплодотворенной яйцеклетки - представляет собой образование сложных пространственно упорядоченных форм из изотропной цитоплазмы зиготы. Вместе с тем уже в начале XX в. классические работы Конклина продемонстрировали явление ооплазматической сегрегации, т. с. структурной упорядоченности цитоплазмы зрелой и оплодотворенной яйцеклетки с полной детерминацией всех исходных стадий морфогенеза. По сути, современные молекулярно-генетические данные окончательно убеждают в строгой ооплазматической сегрегации.

В Базельском университете у дрозофилы были выделены и клонированы гены гомеозисных мутаций [Hafen et al., 1984 ]. С помощью РНК-ДНК гибридизации было показано, что РНК-копии генов, ответственных за формирование отдельных сегментов организма, образовывали четкие скопления в совершенно определенных зонах цитоплазмы ооцита, т. е. наблюдалась строгая структурированность цитоплазмы без каких-либо клеточных перегородок. Эти данные свидетельствуют о фундаментальном принципе организации яйца - регионализации, т. е. распределении информационных макромолекул по определенным участкам цитоплазмы, причем локализация этих участков тесно коррелирует с планом дробления или первых этапов эмбриогенеза.

Следует подчеркнуть, что хотя в современной эмбриологии оогенетическая сегрегация - вполне доказанное явление [Айзенштадт, 1984; Рэфф, Кофмен, 1986 ], механизмы ее становления остаются совершенно "темной" проблемой, от решения которой зависит выяснение механизмов дальнейших этапов онтогенеза.

Попытаемся найти подходы к объяснению феномена оогенетической сегрегации с позиций выявленных нами топологических закономерностей в организации геномов трофоцитов. Напомним, что именно геномы трофоцитов ответственны за развитие ооплазмы у организмов с алиментарным типом оогенсза, к которым относятся малярийные комары и дрозофила. Связь ооцита с каждым из трофоцитов осуществляется цитоплазматичсскими мостиками или кольцевыми каналами [King, 1970].

Формирование яйцевой клетки, как и в целом проблема онтогенеза, рассматривается в современной биологии с позиций трех основных направлений: 1) генетическая теория развития (Дэвидсон); 2) теория физиологических градиентов (Чайлд); 3) теория поля (Гурвич, Кольцов). Первые два направления активно обсуждаются во всех современных сводках по проблемам онтогенеза, поэтому мы не будем на них заострять внимание [Современные ..., 1977; Нейфах, Тимофеева, 1977; Айзенштадт, 1984; Газарян, Белоусов, 1983 ]. Отметим лишь, что эти теории, продуктивные во многих отношениях, бессильны объяснить механизмы становления первичных этапов оогенетической сегрегации. Методология "полевого" подхода базируется на идее "биологического поля", развитой в 30-х гг. гистологом и эмбриологом А. Г. Гурвичем и незаслуженно забытой в настоящее время. Первоначально Гурвич мыслил "поле" как некий материальный фактор, однако впоследствии склонился к тому, что "сама идея поля сможет быть со временем облечена и в язык физики". Стержневым моментом в его концепции был поиск таких инвариантных законов, которые могли бы работать в условиях "неудержимости эмбриогенеза", при непрерывной смене субстрата - "в потоке". "Сначала инвариантность любой ценой, а потом происхождение и идентификация инвариантного начала". Гурвич был противником того, чтобы общую теорию наследствен-ности оценивать только через менделевские принципы. "Формальная генетика оперирует отдельными признаками (доступными для гиб-ридологического анализа) различной природы: химические, цито-логические, макроморфологические. Считается, что организм может быть поделен на признаки (без остатка). Это недопустимо. При-знаки - это конечный результат процессов развития, но анализ самих процессов генетика не считает своей задачей... Мы... при-ходим к логической необходимости признать истинно реальным объектом наследственности сам процесс осуществления типичного хода эмбрионального развития." На основе экспериментов Гурвич показал, что в цитоплазме имеются упорядоченные группировки тех или иных молекул, которые он назвал неравновесными моле-кулярными констелляциями. Существование подобных систем он объяснил наличием неких ориентирующих факторов, или поля.

Источником поля Гурвич считал молекулы ядерного хроматина в момент их синтеза (образования комплекса ДНК - белок), при этом поле ядра существует постоянно, преемственно передаваясь через молекулы ДНП. Суммарный источник поля сосредоточен в центре ядра. Наиболее равновесным положением ядра является геометрический центр клетки. Любая "скошенная" конфигурация клетки будет неравновесной. Каждый источник создает вокруг себя пространственно анизотропное поле, т. е. векторы поля неодинаковы по трем направлениям пространства. Это можно выразить эллипсоидом с тремя неравными осями, описанным вокруг источника поля. Конфигурация эллипсоида анизотропии принимается за видовую постоянную и является в теории поля единственно наследственно преформируемым началом, из которого эпигенетическим путем выводится разнообразие органических форм [Гурвич, 1944].

Этот последний постулат является для нас отправным пунктом для обоснования механизмов становления оогенетической сегрегации на основе видоспецифичной пространственной организации хромосомного аппарата трофоцитов. Прежде чем перейти к формулировке нашего представления, отметим, что физический смысл "полю Гурвича" придал Н. К. Кольцов [1936 ], описавший развитие яйца в терминах электрического силового поля. Оно "создается благодаря выводу из ядра в ооплазму веществ с различными электрическими потенциалами и оно ориентировано согласно общему плану строени ооцита, но детализирующего и закрепляющего этот план. Еще до созревания этот план в существенных чертах намечен, преформирован". В 1930 г. Спэк [Кольцов, 1936] обнаружил в яйце Nereis катафорезные токи, возникающие за счет разницы потенциалов и обеспечивающие перемещение веществ в ооплазме.

На современном уровне это убедительно подтвердили Вудруфф и Телфер [Woodruff," Telfer, 1973] на бабочке цекропии. Переход рРНК из трофоцитов в ооцит осуществляется в составе РНП-частиц (типа рибосом) не посредством градиента концентрации, а за счет разницы потенциалов ооцита и трофоцитов. С помощью микроздектродов в фолликулы был инъецирован меченный флуорохромом белок. Оказалось, что белок может проходить по цитоплазматическим мостикам от трофоцита к ооциту, но не наоборот. Авторы с помощью внешнего напряжения (с током 5x10-8А) смогли изменить полярность, и меченый глобулин стал переходить из ооцита в трофоциты. Измерение потенциала в трофоцитах дало -40 мВ, в ооцитах -30 мВ. Таким образом, разность потенциалов в 10 мВ и является основным условием перехода рибонуклеотидов из трофоцитов в ооцит. В течение нескольких дней содержание РНК в ооцитах цекропии увеличивается в 5 раз (от 0,5 мкг до 2,5 мкг), а в трофоцитах уровень РНК сохраняется постоянным (0,5 мкг).

Таким образом, электрокинетические принципы становления ооплазмы на основе общей теории поля Гурвича могут быть убедительно, с нашей точки зрения, соотнесены с выявленными нами системными мутациями. Гипотетически можно принять следующие постулаты.