Тема 4. Лимитированный рост популяции. Хемостат. Экономический коэффициент и траты на поддержание

Теория: Данный раздел теории разработан в основном для популяций микроорганизмов, однако при соблюдении определенных условий и постоянстве внешних параметров он приложим также для описания динамики популяций многоклеточных организмов.

Экономический коэффициент. Траты на поддержание: Для описания и сравнения эффективности утилизации субстрата S при росте организмов используется так называемый экономический коэффициент Y, который определяется как

, (4.1)

где X и S соответственно концентрации биомассы и изучаемого субстрата. Данный параметр отражает прирост биомассы на единицу потребляемого субстрата и является важнейшей характеристикой ростовых процессов. По причинам, изложенным ниже, он также называется суммарным экономическим коэффициентом. Размерность экономического коэффициента зависит от применяемых размерностей концентрации биомассы и субстрата.

Если лимитирующий субстрат является источником углерода и энергии для процессов биосинтеза, то его значение, как правило, меньше единицы. Данный субстрат при потреблении затрачивается на два типа процессов. Первый тип процессов связан с собственно ростом и размножением. В этом случае эффективность потребления энергетического субстрата характеризуют так называемым ростовым экономическим коэффициентом Yрост. Размерность данного параметра такая же, что и у определенного выше суммарного экономического коэффициента. Второй тип процессов связан с затратами на поддержание уже имеющейся биомассы – сохранением всех трансмембранных градиентов, восстановлением постоянно разрушающихся биополимеров, биомембран и т.д. В физиологии это называют основным обменом. Количественно траты энергетического субстрата на эти процессы характеризуют параметром m, называемым траты на поддержание. Размерность этого параметра – [время-1]. Суммарный экономический коэффициент Y, ростовой экономический коэффициент Yрост и траты на поддержание m согласно теории связаны следующим соотношением (Перт, 1978):

, (4.2)

где r - удельная скорость роста биомассы популяции. Соответственно, кинетика потребления субстрата на рост и поддержание биомассы описывается уравнениями:

. (4.3)

Динамика лимитированного роста популяции: Выделяют два типа процессов лимитированного роста популяций. В первом из них субстрат вносится в систему однократно, и далее он в процессе роста только потребляется. В микробиологии и биотехнологии такой процесс называют периодическим культивированием. Во втором процессе, который называется непрерывным культивированием, в ходе роста популяции субстрат постоянно добавляется в систему, при этом изымается избыток биомассы. Система, в которой скорости подачи субстрата и изъятия биомассы постоянны, называется хемостат (Перт, 1978; Smith, Waltman, 1995). Поскольку динамические уравнения, описывающие данные системы, несколько отличаются, рассмотрим их отдельно.

Периодическое культивирование: Динамика популяции в условиях периодического культивирования описывается следующей системой уравнений, известных как модель Моно (Перт, 1978; Варфоломеев, Гуревич, 1999):

(4.4)

Здесь X – концентрация биомассы, S - концентрация лимитирующего субстрата, t – время, rmax - максимальная удельная скорость роста, KS - константа насыщения, Y - экономический коэффициент. Система (4.4) имеет аналитическое решение вида (Перт, 1978; Варфоломеев, Гуревич, 1999):

. (4.5)

Здесь S0 и X0 - начальные концентрации субстрата и биомассы соответственно. На практике часто применяется также первый интеграл системы (4.4):

(4.6)

Непрерывное культивирование. Хемостат: Для описания лимитированного роста популяции в хемостате применяют следующую систему уравнений (Перт, 1978; Варфоломеев, Гуревич, 1999):

(4.7)

Обозначения здесь те же, что и в системе (4.4), параметр D называется протоком, он численно равен скорости подачи питательной среды (субстрата) в культиватор (ферментер), нормированной на эффективный объем культиватора. Размерность протока – [время-1] . На практике часто используют соотношения, получаемые из анализа стационарного состояния хемостата (Перт,1978):

. (4.8)

Здесь - стационарная удельная скорость роста популяции, и - стационарные концентрации субстрата и биомассы.

Задача 4.1

Условия: Культуру клеток кишечной палочки E.coli выращивали в аэробных условиях на бедной минеральной среде с глюкозой, содержащей в качестве единственного источника азота хлорид аммония в лимитирующих рост концентрациях. В ходе опыта измеряли концентрацию биомассы клеток и концентрацию лимитирующего субстрата, хлорида аммония (Керридж, Типтон, 1974). Данные представлены в таблице 4.1.

Таблица 4.1.

Концентрация хлорида аммония, S, г/л

Концентрация биомассы клеток, X, г/л

S0 – S

г/л

X – X0

г/л

0,10

0,08

0,00

0,00

0,25

0,22

0,15

0,14

0,40

0,32

0,30

0,25

0,50

0,43

0,40

0,35

0,60

0,49

0,50

0,41

0,70

0,59

0,60

0,51

Вопросы: Определить по представленным данным экономический коэффициент Y для хлорида аммония у исследуемой популяции.

Решение: Напомним, что экономический коэффициент Y выражает количественные потребности организмов (клеток) в пище и равен по определению Y = dX/dS, где X и S соответственно концентрации биомассы и изучаемого субстрата. В условиях лимитированного роста популяции, когда субстрат вводится в систему однократно в начале опыта, экономический коэффициент связывает концентрацию субстрата и концентрацию биомассы клеток (организмов) соотношением (4.6):

Используем данное уравнение для решения поставленной задачи. Для этого рассчитаем вспомогательные переменные X – X0 и S0 – S, как это указано в таблице 4.1 (3 и 4 столбцы). Далее построим график в этих вспомогательных координатах, используя данные из 3 и 4 столбцов таблицы 4.1 (рис.4.1).

Рис.4.1. Определение экономического коэффициента Y по данным из таблицы 4.1.

Экспериментальные данные, как видно, группируются около прямой линии, тангенс угла которой равен искомому экономическому коэффициенту. Таким образом, экономический коэффициент для хлорида аммония у исследуемой популяции кишечной палочки равен : Y = 0.834 г биомассы на 1 г хлорида аммония.

Задача 4.2

Условия: С целью определения кинетических параметров,KS и rmax, и экономического коэффициента Y, характеризующих рост популяции кишечной палочки E.coli на глюкозе, проводили периодическое культивирование клеток E.coli на бедной минеральной среде с лимитированием по данному субстрату до выхода популяции в стационарную фазу. В ходе эксперимента измеряли концентрацию биомассы клеток и концентрацию глюкозы.

Результаты (в интервале от начала экспоненциальной фазы роста до фиксирования стационарного состояния) представлены в табл. 4.2 и на рис.4.2.

Таблица 4.2.

Время,t

час

Концентрация

биомассы, X

мг/л

Концентрация

глюкозы, S

мг/л

S0 - S

XX0

0

20

2000

0

0

0,5

30,52

1976

23,4

10,5

0,845299

-0,023515

1

46,6

1940

59,1

26,6

0,845868

-0,030001

1,5

71,1

1886

113,5

51,1

0,845570

-0,038968

2

108,5

1803

196,6

88

0,845508

-0,051755

2,5

165,5

1676

323,3

145

0,845295

-0,070535

3

252,5

1483

516,6

232

0,845226

-0,099618

3,5

385

1188

811,1

365

0,845003

-0,148608

4

587

740

1260

567

0,844823

-0,248563

4,33

773

326

1673

753

0,844006

-0,418467

4,5

885

77

1922

865

0,842190

-0,721565

4,56

918

4,4

1995

898

0,839137

-1,339747

4.564

919

2,2

1997

899

0,838608

-1,490388

5

920

0

2000

900

5,5

920

0

2000

900

Рис.4.2. Изменение концентрации биомассы, X, и концентрации глюкозы, S, в ходе периодического культивирования популяции E.coli.

Вопросы: Определить по представленным данным значения кинетических параметров, KS и rmax, и экономического коэффициента, Y, характеризующих рост популяции кишечной палочки E.coli на глюкозе.

Решение: Определим на первом этапе значение экономического коэффициента, как это указано в задаче 4.1.

Рис.4.3. Определение экономического коэффициента Y по данным из таблицы 4.2.

Для этого рассчитаем вспомогательные переменные S0 S и XX0 (таб.4.2, 4 и 5 столбцы) и построим график в этих координатах, используя данные из 4 и 5 столбцов таблицы 4.2 (рис.4.3). Тангенс угла наклона регрессионной прямой, проведенной через экспериментальные точки, дает значение экономического коэффициента: Y = 0.45. Проверим соответствие данного значения экономического коэффициента экспериментальным данным. Согласно теории стационарное значение концентрации биомассы должно удовлетворять соотношению . Используя данные из таб.4.2 получаем: = 920 мг/л, =20мг/л, =2000мг/л 920 = 0.45*2000 + 20 = 920. Соответствие налицо.

Для определения кинетических параметров, KS и rmax, используем линейную анаморфозу интегральной формы уравнения клеточного роста (4.5)(Варфоломеев, Гуревич, 1999):

. (4.9)

С этой целью на основе данных из столбцов 1 и 2 таб.4.2 рассчитаем вспомогательные переменные и , как это указано в таб.4.2, столбцы 6 и 7, и построим график в этих координатах (рис.4.4).

Рис.4.4. Определение кинетических параметров роста клеток KS и rmax по данным из таб.4.2. и рис.4.2

Как видно, экспериментальные данные группируются около прямой линии, точка пересечения которой с осью ординат дает значение = 0.8458 час-1, а тангенс угла наклона – значение = 0.00485. Отсюда нетрудно рассчитать значения параметровK S и rmax: KS = 9.75 мг/л, rmax = 0.85 час-1.

Задача 4.3

Условия: Исследовали кинетику роста популяции бактерий Pseudomonas fluorescens в хемостате при различных значениях протока D и концентрации лимитирующего субстрата, глюкозы, в подаваемой питательной среде S0. В каждом случае при достижении стационарного состояния хемостата измерялась концентрация биомассы клеток X и концентрация глюкозы S. Данные измерений представлены в таблице 4.3.

Таблица 4.3.

Концентрация субстрата в подаваемой питательной среде, , мМ Проток,
час-1

Стационар-ная концен-трация биомассы,

, г/л

Стационар-ная концен-трация субстрата,

, мМ

4

0,1

1,903

0,025

3,97

10

40

4

0,2

1,822

0,056

3,94

5

17,85

4

0,4

1,812

0,168

3,83

2,5

5,95

4

0,6

1,67

0,49

3,51

1,67

2,04

4

0,75

1,041

1,858

2,14

1,33

0,54

             

8

0,1

1,921

0,025

7,97

10

40

8

0,2

1,892

0,056

7,94

5

17,86

8

0,7

1,67

1,04

6,96

1,43

0,96

8

0,75

1,417

1,875

6,12

1,33

0,53

8

0,8

0,27

7,198

0,80

1,25

0,14

             

16

0,2

1,882

0,057

15,94

5

17,54

16

0,4

1,89

0,169

15,83

2,5

5,92

16

0,7

1,728

1,038

14,96

1,43

0,96

16

0,75

1,685

1,883

14,12

1,33

0,53

16

0,8

1,093

7,095

8,90

1,25

0,14

Вопросы: Определить по представленным данным значения кинетических параметров, KS и rmax, и экономического коэффициента, характеризующих рост в хемостате популяции бактерий Pseudomonas fluorescens в указанных условиях.

Решение: Используем для решения поставленной задачи известные из теории хемостата соотношения (4.8), описывающие стационарное состояние культуры клеток (Перт, 1978):

.

Для определения экономического коэффициента применим второе соотношение, предварительно произведя расчет вспомогательной переменной (таб.4.3, 5-ый столбец) и представив данные из таблицы (3 и 5 столбцы) в координатах {,}. Графики будем строить отдельно для каждого значения . На рис.4.5 представлены данные и расчет экономического коэффициента для = 4 мМ. Как видно, для данной концентрации Y1 = 0.45 г/мМ.

Рис.4.5. Определение экономического коэффициента Y1 по данным из таб.4.5 для = 4 мМ

Аналогично находим значения экономического коэффициента для двух других начальных концентраций лимитирующего субстрата (рис.4.6.): Y2 = 0.23 г/мМ и Y3 = 0.11 г/мМ.

Рис.4.6. Определение значений экономического коэффициента по данным из таб.4.5 для = 8 мМ (Y2) и = 16 мМ (Y3)

Для определения кинетических параметров роста клеток, KS и rmax, используем линейную анаморфозу первого из вышеуказанных соотношений (Перт, 1978):

. (4.10)

С этой целью рассчитаем вспомогательные переменные, и , как это указано в таб.4.4, столбцы 6-ой и 7-ой, и, далее, для каждого значения построим график в этих координатах. Экспериментальные данные должны сгруппироваться около прямой линии, которая отсекает на оси абсцисс значение , а на оси ординат – значение . На рис.4.8 (вверху) представлены данные для = 4 мМ. Произведенный расчет дает следующие значения для искомых кинетических параметров: rmax = 0.82 час-1, KS= 0.17 мМ.

Рис.4.8. Определение кинетических параметров роста клеток KS и rmax по данным хемостатного культивирования для = 4 мМ (вверху), а также для = 8 мМ и = 16 мМ (внизу) на основе данных из таб.4.3

Из нижнего графика на рис.4.8 следует, что значения KS и rmax для = 8 мМ и = 16 мМ идентичны и равны таковым для = 4 мМ.

Таким образом, из полученных результатов следует, что при хемостатном культивировании исследуемых бактерий на глюкозе как лимитирующем субстрате увеличение ее начальной концентрации с 4 мМ до 16 мМ существенно снижает экономический коэффициент с 0.45 до 0.11 г/мМ и не влияет на значения кинетических параметров роста KS и rmax, которые соответственно равны rmax = 0.82 час-1, KS = 0.17 мМ. По-видимому, это свидетельствует о переключении типа энергетического метаболизма с полностью затратного на запасающий и неизменности транспортных систем для глюкозы.

Задача 4.4

Условия: Исследовали динамику популяции кишечной палочки E.coli при культивировании в хемостате на бедной минеральной среде при лимитировании глюкозой, начальная концентрация которой в подаваемой среде (S0) составляла 0.666 г/л. Изучали поведение популяции во время переходного процесса, обусловленного изменением протока через ферментер с величины D исх = 0.25 час-1 на величину D = 0.765 час-1. В ходе эксперимента определяли концентрацию биомассы клеток и концентрацию глюкозы. За нулевую отметку времени был взят момент смены протока. Данные представлены в таблице 4.4 и на рис.4.9 (Евдокимов и др., 2000).

Таблица 4.4

Время,
t
, час
Концентрация биомассы, X,г/л Концентрация субстрата, S,г/л

0

0,166

0,198

0,468

1

0,142

0,297

0,369

-0,15644

-0,18693

2

0,116

0,326

0,34

-0,17799

-0,21741

3

0,099

0,396

0,27

-0,17175

-0,21418

4

0,095

0,446

0,220

-0,13984

-0,1755

5

0,078

0,446

0,220

-0,15167

-0,1966

10

0,064

0,506

0,16

-0,09531

-0,12852

14

0,058

0,509

0,157

-0,07511

-0,10373

24

0,049

0,531

0,135

-0,05084

-0,07378

30

0,039

0,586

0,08

-0,04828

-0,07699

48

0,025

0,594

0,072

Рис.4.9. Изменение концентрации биомассы клеток кишечной палочки при культивировании в хемостате при изменении протока: 0.25 час-1 0.765 час-1.

Стрелкой указан момент изменения протока.

Вопросы: Определить по представленным данным значения кинетических параметров, KS и rmax, и экономического коэффициента, характеризующих рост в хемостате популяции бактерий E.coli в указанных условиях переходного процесса.

Решение: На первом этапе определим среднее значение экономического коэффициента в ходе процесса, исходя из предположения, что он изменяется несущественно при смене протока. Для этого воспользуемся подходом, рассмотренным в предыдущей задаче. Вспомогательная переменная представлена в 4-ом столбце таб.4.4, а решение – на рис.4.10.

Как видно, экспериментальные данные достаточно компактно группируются около прямой линии. Это свидетельствует о том, что в течение переходного процесса изменения концентрации биомассы и субстрата связаны таким же соотношением, как и в стационарном состоянии:, и среднее значение экономического коэффициента = 0.35 достаточно стабильно.

Рис.4.10. Определение среднего значения экономического коэффициента по данным из таб.4.4

Для определения кинетических параметров, KS и rmax, используем следующую теорию, развитую в работе (Евдокимов, Шаповалов, 2000). Согласно это теории, если хемостатная культура клеток находится в стационарном состоянии при протоке Dисх, и далее проток изменяется Dисх D, то начиная с момента смены протока динамика системы описывается следующим уравнением:

,(4.11)

где и - стационарная концентрация биомассы при протоке D. Уравнение (4.11) будем использовать в виде следующей линейной анаморфозы:

. (4.12)

При расчете вспомогательных переменных, и , (таб.4.4, столбцы 5-ый и 6-ой), применялись следующие значения начальной и стационарной концентраций биомассы клеток: =0.166 мг/л и =0.025 мг/л. Экспериментальные данные, представленные в указанных координатах, как видно из рис.4.11, группируются около прямой линии, которая согласно выражению (4.6), отсекает на оси ординат значение , а тангенс угла ее наклона дает значение .

Рис.4.11. Определение кинетических параметров роста клеток KS и rmax по данным хемостатного культивирования на основе данных из таб.4.4

Далее, решая найденные соотношения как систему уравнений с двумя неизвестными, легко найти искомые значения кинетических параметров: rmax= 0.8 час-1, KS = 13.6 мг/л.

Задача 4.5

Условия: Исследовали кинетику потребления энергетического субстрата, глюкозы, при росте популяции кишечной палочки E.coli в хемостате в стационарных условиях. Опыты проводили при различных начальных концентрациях глюкозы и значениях протока. В ходе эксперимента измеряли стационарные концентрации биомассы и глюкозы. Данные представлены в таблице 4.5.

Таблица 4.5

Начальная концентрация глюкозы, S0,мМ Проток, D,час-1 Стационарная концентрация биомассы, , г/л Стационарная концентрация глюкозы, , мМ Y

4

0,1

1,74

0,03

0,438

10

2,28

4

0,2

1,93

0,06

0,49

5

2,04

4

0,4

2

0,18

0,524

2,5

1,91

4

0,6

1,88

0,49

0,536

1,67

1,87

4

0,75

1,13

1,91

0,541

1,33

1,85

8

0,1

1,96

0,03

0,246

10

4,07

8

0,2

2,08

0,06

0,262

5

3,82

8

0,7

1,92

1,02

0,275

1,43

3,64

8

0,75

1,68

1,88

0,275

1,33

3,64

8

0,8

0,28

6,98

0,274

1,25

3,64

16

0,2

2,16

0,06

0,136

5

7,38

16

0,4

2,18

0,17

0,138

2,5

7,26

16

0,7

2,08

1,01

0,1388

1,43

7,21

16

0,75

1,96

1,86

0,1386

1,33

7,21

16

0,8

1,26

6,94

0,1390

1,25

7,19

Вопросы: Определить по представленным данным значения ростового экономического коэффициента Yрост и трат на поддержание m, характеризующих кинетику потребления энергетического субстрата, глюкозы, при росте популяции бактерий E.coli в хемостате в указанных условиях.

Решение: На первом этапе решения определим для каждого варианта условий значение суммарного экономического коэффициента Y. Для расчетов Y (5-ый столбец таб.4.5.) будем использовать соотношение (4.8) в виде и данные из 1-го, 3-го и 4-го столбцов таб.4.5.

В соответствии с теорией суммарный экономический коэффициент Y, ростовой экономический коэффициент Yрост и траты на поддержание m связаны соотношением (4.2):

.

Учитывая, что в стационарном состоянии в хемостате удельная скорость роста популяции r равна протоку D,будем использовать соотношение (4.2) в виде:

. (4.13)

Рис.4.12 - 4.13. Определение ростового экономического коэффициента Yрост и трат на поддержание m по данным из таб.4.5 для S0 = 4 мМ (вверху) и S0 = 8мМ (внизу)

С этой целью рассчитаем вспомогательные переменные и (столбцы 6-ой и 7-ой таб.4.5) и построим графики в этих координатах для каждого значения начальной концентрации глюкозы S0 (рис.4.12-4.14).

Экспериментальные данные на этих графиках группируются около прямых линий, которые согласно выражению (4.13) отсекают на оси ординат значение 1/Yрост, а тангенсы угла наклона дают значения m.

Рис.4.14 . Определение ростового экономического коэффициента Yрост и трат на поддержание m по данным из таб.4.5 для S0 = 16 мМ

Полученные в результате значения ростового экономического коэффициента и трат на поддержание представлены в таб.4.6.

Таблица 4.6

Начальная концентрация глюкозы, S0, мМ

Ростовой экономический коэффициент, Yрост , г/мМ

Траты на поддержание, m, час-1

4

0,56

0,05

8

0,28

0,049

16

0,14

0,048

Тема 5. Ингибирование роста и размножения химическими факторами

Теория: Кинетика ингибирования роста и размножения химическими факторами в биологических популяциях сложна и достаточно разработана лишь для популяций микроорганизмов, когда торможение ростовых процессов можно свести к ингибированию отдельных ферментативных реакций или транспортных систем. Соответственно, уравнения, описывающие торможение роста клеток в зависимости от концентрации ингибитора, подобны уравнениям ферментативной кинетики (Перт, 1978; Печуркин, 1978).

Конкурентное ингибирование:

. (5.1)

Неконкурентное ингибирование (уравнение Иерусалимского):

. (5.2)

Ингибирование избытком субстрата (уравнение Эндрюса):

. (5.3)

Здесь r(S,I) - удельная скорость роста популяции, S - концентрация лимитирующего субстрата, I - концентрация ингибитора, rmax - максимальная удельная скорость роста, KS - константа насыщения для данного субстрата, KI - константа ингибирования.

При наличии кооперативных эффектов при ингибировании для анализа данных можно предложить модифицированное уравнение Иерусалимского:

, (5.4)

где n - коэффициент нелинейности ингибирования. Константа ингибирования численно равна той концентрации ингибитора, при которой скорость роста популяции уменьшается вдвое.

Кинетика, соответствующая модифицированному уравнению Иерусалимского, наиболее часто встречается при ингибировании роста микроорганизмов различными антибиотиками, ксенобиотиками и ионами тяжелых металлов. Типичный вид зависимостей при различной степени нелинейности ингибирования представлены на рис.5.1.

Рис.5.1. Ингибирование роста популяции в соответствии с модифицированным уравнением Иерусалимского

Задача 5.1

Условия: Исследовали кинетику ингибирования роста популяции бактерий E.coli ионами серебра Ag+. С этой целью в пять колб с питательной средой (минеральной с глюкозой) и различной концентрацией нитрата серебра было добавлено одинаковое количество клеток бактерий. Культивирование клеток проводили при оптимальной температуре 370С и необходимом уровне аэрации. В ходе опыта измеряли оптическую плотность культуры. Данные представлены в таблице 5.1.

Таблица 5.1.

Оптическая плотность культуры клеток, Ex

Время, t, час

[Ag+] = 0

[Ag+] = 0,02мМ

[Ag+] = 0,04мМ

[Ag+] = 0,06мМ

[Ag+] = 0,08мМ

2

0,01

0,01

0,01

0,01

0,01

4

0,01

0,01

0,01

0,01

0,01

6,5

0,011

0,012

0,012

0,011

0,011

7

0,021

0,016

0,014

0,013

0,013

8,5

0,065

0,033

0,024

0,02

0,018

9,8

0,173

0,062

0,039

0,029

0,024

10,4

0,271

0,083

0,048

0,034

0,028

11,5

0,619

0,142

0,071

0,047

0,036

Вопросы: Определить по представленным данным значения константы KI и коэффициента нелинейности n ингибирования роста бактерий E.coli ионами серебра.

Решение: Сначала для каждой колбы (каждой концентрации ионов серебра) найдем значения удельной скорости роста популяции клеток r(I) по алгоритму, рассмотренному в задаче 1.1. Отметим, что при ингибировании роста часто проявляется эффект начальной задержки роста культуры клеток, известный как эффект лаг-фазы. Для определения длительности лаг-фазы данные из таблицы 5.1. представим в координатах {t, ln(Ex)}. Тогда лаг-фаза будет соответствовать горизонтальному участку кривой, а экспоненциальная фаза роста – наклонной прямой (рис.5.2.).

Рис.5.2. Лаг-фаза и экспоненциальный рост популяции клеток E.coli

При определении удельной скорости роста популяции будем использовать только экспоненциальную фазу. Для этого в качестве начальной точки роста будем брать вторую точку, в которой значение оптической плотности отлично от исходного значения (для первой отличающейся точки не определен момент времени начала роста). В рассматриваемом примере на рис.5.2. – это точка, соответствующая времени t = 7 часов.

Линеаризованные данные в скорректированных координатах представлены на рис.5.3., а соответствующие им результаты определения удельной скорости роста популяции E.coli в колбах с различной концентрацией ионов серебра представлены в таблице 5.2 и на рис.5.4.

Таблица 5.2.

Концентрация ионов серебра, мМ

0

0,02

0,04

0,06

0,08

Удельная скорость роста, час-1

0,752

0,485

0,362

0,285

0,227

Рис.5.3. Определение удельной скорости роста популяции клеток E.coli при различной концентрации ионов серебра в среде по данным из таб.5.1.

Рис.5.4. Зависимость удельной скорости роста популяции клеток E.coli от концентрации ионов серебра в среде

Как видно из рис.5.4, зависимость удельной скорости роста популяции клеток E.coli от концентрации ионов серебра в среде, по-видимому, описывается уравнением Иерусалимского (5.4).

Для нахождения параметров уравнения Иерусалимского, константы ингибирования KI и коэффициента нелинейности ингибирования n, используем следующую линейную анаморфозу:

, (5.5)

где r0 – удельная скорость роста популяции при нулевой концентрации ингибитора, rI – удельная скорость роста популяции при концентрации ингибитора, равной I. На основе данных из таблицы 5.2 рассчитаем вспомогательные переменные, ln I и , как это указано в таблице 5.3, и построим график в этих переменных (рис.5.5).

Таблица 5.3.

ln I

-

-3,912

-3,219

-2,813

-2,526

-

-0,597

0,075

0,494

0,838

Рис.5.5. Определение параметров уравнения Иерусалимского по данным из таблицы 5.3.

Экспериментальные точки в соответствии с уравнением (5.5) должны группироваться около прямой линии, тангенс угла которой дает значение коэффициента нелинейности ингибирования n, а точка ее пересечения с осью абсцисс – значение натурального логарифма константы ингибирования KI. Для рассматриваемого случая n = 1, ln (KI) = -3,32, KI = 0,036 мМ, что и требовалось найти.

Задача 5.2

Условия: Для определения кинетики ингибирующего влияния ионов лития на процесс размножения дрозофил на личиночной стадии измеряли процент выплода взрослых мух (имаго) из определенного количества отложенных яиц в зависимости от концентрации лития в питательной среде для личинок. Данные представлены в таблице 5.4.

Таблица 5.4.

Концентрация

ионов лития, г/л

Процент выплода

%

ln I

0

100

-

-

0,1

98,4

-2,30259

-4,14313

0,2

89,0

-1,60944

-2,09714

0,25

71,8

-1,38629

-0,93827

0,3

62,5

-1,20397

-0,51083

0,35

43,7

-1,04982

0,251314

0,45

23,4

-0,79851

1,18377

0,55

6,25

-0,59784

2,70805

0,65

4

-0,43078

3,178054

0,75

0

-

-

0,85

0

-

-

Вопросы: Проанализировать полученные результаты и определить необходимые кинетические параметры, характеризующие влияние ионов лития на процесс размножения дрозофил.

Решение: Развитие личинок из яиц, их питание, формирование полноценных куколок и далее имаго наряду с плодовитостью являются важными составляющими процесса размножения дрозофил. Количественную оценку их приспособленности на этой стадии дает процент выплода имаго из определенного числа яиц. Построим график зависимости процента выплода от концентрации ионов лития в среде на основе данных из таблицы 5.4 (1 и 2 столбцы) – рис.5.6.

Рис.5.6. Зависимость процента выплода имаго дрозофил от концентрации ионов лития в корме для личинок

Как видно из рисунка, эта зависимость имеет явный S-образный характер, т.е. отражает неконкурентный кооперативный тип

Рис.5.7. Определение параметров уравнения Иерусалимского по данным из таблицы 5.4.

ингибирования, и, очевидно, описывается модифицированным уравнением Иерусалимского (5.4).

Параметры уравнения определим на основе той же линейной анаморфозы уравнения Иерусалимского (5.5), что и в задаче 5.1. Рассчитаем вспомогательные переменные ln I и (таблица 5.4, 3 и 4 столбцы) и построим график в этих переменных (рис.5.7). Значение коэффициента нелинейности ингибирования n равно тангенсу угла наклона регрессионной прямой, проведенной через экспериментальные точки. Для рассматриваемого случая n = 4, что, по-видимому, свидетельствует о существенно нелинейном характере процесса ингибирования. Константу ингибирования KI найдем из ее натурального логарифма, который определяется из точки пересечения регрессионной прямой с осью абсцисс (рис.5.7): KI = 0,31 г/л.

Задача 5.3

Условия:В Ханты-Мансийском автономном округе на Южно-Сургутском нефтепромысле методами биотехнологии проводили очистку участков почвы от нефтяных загрязнений. После завершения рекультивационных работ проверяли остаточную токсичность почвы для растений путем высева луговых трав и определения всхожести их семян. В таблице 5.5 представлены такие данные для мятлика Poa sibirica.

Таблица 5.5

Концентрация

нефтепродуктов,

I, г/кг

Всхожесть

семян, %

rI

ln I

0

100

50

100

3,912023

100

90

4,60517

-2,19722

150

70

5,010635

-0,8473

200

60

5,298317

-0,40547

250

40

5,521461

0,405465

300

30

5,703782

0,847298

350

20

5,857933

1,386294

Вопросы: Определить по представленным данным кинетику ингибирования всхожести семян мятлика остаточными нефтепродуктами.

Решение: Будем считать, что концентрация остаточных нефтепродуктов в почве в первом приближении пропорциональна исходной концентрации нефтеконтаминантов. Для определения типа ингибирования построим график зависимости всхожести семян от концентрации нефтепродуктов (1 и 2 столбцы таб.5.5) - рис.5.8.

Рис.5.8. Зависимость всхожести семян мятлика на почве, подвергнутой биоочистке, от исходной концентрации нефтепродуктов-загрязнителей

Вид кривой ингибирования на рис.5.8 показывает, что данная зависимость имеет кооперативный (S-образный характер) характер и, по-видимому, описывается модифицированным уравнением Иерусалимского (5.4), в котором r0 = 100.

Дальнейший ход решения аналогичен задачам 5.1 и 5.2:

  • параметры уравнения определяются на основе линейной анаморфозы уравнения Иерусалимского (5.5)
  • рассчитываются вспомогательные переменные ln I и (таблица 5.5, 3 и 4 столбцы)
  • строится график в этих переменных (рис.5.9)
  • через экспериментальные точки проводится регрессионная прямая
  • пересечение регрессионной прямой с осью абсцисс дает значение ln KI = 5.384
  • из тангенса угла наклона регрессионной прямой определяется коэффициент нелинейности ингибирования.
  • Рис.5.9. Определение параметров уравнения Иерусалимского по данным из таблицы 5.5.

    Таким образом, кинетика ингибирования всхожести семян мятлика остаточными нефтеконтаминантами в почве описывается модифицированным уравнением Иерусалимского со следующими параметрами (в перерасчете на исходные концентрации нефтепродуктов-загрязнителей): KI = 218 г/кг, n = 2,77.

    Тема 6. Динамика конкуренции и отбора в популяциях

    Теория: Динамика отбора в гаплоидных популяциях, популяциях с бесполым размножением, а также в диплоидных популяциях с половым размножением в гаплоидном приближении без учета мутационного процесса описывается системой уравнений Эйгена-Фишера (Эйген, Шустер, 1982):

    (6.1)

    где pi – относительная численность особей с i-ым генотипом, ri – их удельная скорость роста, < r > - средняя по популяции удельная скорость роста, N – число различных генотипов в популяции. Учет мутационного процесса приводит к аналогичному виду уравнений при соответствующей замене переменных, учитывающих частоты мутационных и рекомбинационных переходов (Эйген, Шустер, 1982). В нелимитированных условиях при постоянных значениях удельной скорости роста (ri=const) система уравнений (6.1) имеет аналитическое решение (Цоглин и др., 1970):

    . (6.2)

    Здесь pi0 , pk0 – начальные значения. Полезным для практики является следующее из (6.2) соотношение, описывающее изменение относительной численности особей двух разных генотипов:, (6.3)

    где xi0, xk0, xi и xk – начальные и конечные численности особей с i-ым и k-ым генотипами соответственно, t – время наблюдения. Отбор в нелимитированных условиях направлен на увеличение удельной скорости роста: , его называют также r-отбором.

    Для условий лимитированного роста популяций, зависимого, например, от количества субстрата S, находящегося в минимуме, или для иного типа плотностно-зависимого роста удельные скорости роста ri не являются постоянными и изменяются во времени. В этом случае выражение (6.2) имеет вид

    (6.4)

    где - средняя по времени удельная скорость размножения особей i–го генотипа. Для субстрат-зависисмого роста отбор направлен на уменьшение средней по популяции константы насыщения: , для плотностно-зависимого (логистического) роста отбор направлен на увеличение ресурсного параметра: . Этот вид отбора называют К-отбором (Печуркин,1978).

    Известна так же Основная теорема естественного отбора Фишера, которая для выше рассмотренных популяций имеет следующее выражение:

    . (6.5)

    Здесь - дисперсия удельной скорости роста в популяции.

    Задача 6.1

    Условия: В ферментере в условиях нелимитированного культивирования выращивали популяцию бактерий Pseudomonas sp. при использовании формальдегида в качестве субстрата, единственного источника углерода и энергии. Применяемый штамм бактерий в условиях эксперимента имел удельную скорость роста r = 0,25 час-1.

    Вопросы: Рассчитать примерное время вытеснения исходного штамма бактерий мутантным, клетки которого более резистентны к формальдегиду и имеют более высокую удельную скорость роста r = 0,43 час-1, если известно, что частота появления таких мутаций равна на одну генерацию. За критерий вытеснения взять соотношение концентраций клеток исходного штамма к мутантному .

    Решение: Рассчитаем максимальный необходимый для указанного конкурентного замещения штаммов временной интервал. Для этого используем соотношение (6.3):


    .


    Задача 6.2

    Условия: В исследованиях по микроэволюции популяции дрожжей-сахаромицетов при их нелимитированном культивировании в турбидостате регистрировались данные о динамике конкуренции трех штаммов клеток, отличающихся по форме колоний. Для этого в ходе эксперимента путем высева образцов культуры клеток на чашки Петри определялось среднее количество клеток каждого штамма в расчете на 1000 клеток. Данные представлены в таблице 6.1 и на рис.6.1.

    Таблица 6.1

    Время,

    час

    Штамм 1,

    x1

    Штамм 2,

    x2

    Штамм 3,

    x3

    0

    990,00

    9,50

    0,50

    0

    0

    10

    979,58

    18,93

    1,49

    0,7

    1,1

    20

    958,34

    37,29

    4,37

    1,4

    2,2

    30

    915,70

    71,76

    12,54

    2,1

    3,3

    40

    834,07

    131,62

    34,31

    2,8

    4,4

    50

    693,79

    220,47

    85,74

    3,5

    5,5

    60

    497,22

    318,18

    184,60

    4,2

    6,6

    70

    293,77

    378,57

    327,66

    4,9

    7,7

    80

    143,98

    373,62

    482,41

    5,6

    8,8

    90

    61,38

    320,76

    617,86

    6,3

    9,9

    100

    23,94

    251,98

    724,08

    7

    11

    Рис.6.1. Изменение удельной численности клеток разных штаммов дрожжей в ходе отбора в турбидостате